免費發(fā)布：急性肝胰腺壞死病檢測方法

cuiluosheng

附件內的《急性肝胰腺壞死病檢測方法公告》為泰國Mahidol大學Tim Flegel教授與臺灣成功大學羅竹芳教授最新發(fā)布的檢測方法公告，在閱讀他們公告的過程中深為二位專家以及他們團隊的行業(yè)責任感所折服，為此，學習完報告之后，遂盡自己的微薄之力將之翻譯好，供行業(yè)相關人員參考、交流、學習！


AHPND細菌PCR檢測方法公告.pdf (654.78 KB, 下載次數(shù): 32)

2013-12-30 12:54 上傳

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閱讀權限: 80

胡路怡

好文章好文章，崔兄辛苦了哈

一醉千年

崔兄速度夠快！我上午看著新聞了，英文不夠好，勉勉強強翻譯了兩段。你這全文翻譯了，辛苦辛苦！

my_chb

{:soso_e179:}

daoming4

非常感謝能夠將前沿信息及時傳遞給大家，只是感覺翻譯的有點生硬。

raymin

支持支持支持支持支持

zjxenter

謝謝分享呀  以后用到再下載 呵呵

cuiluosheng

daoming4 發(fā)表于 2013-12-26 14:01
非常感謝能夠將前沿信息及時傳遞給大家，只是感覺翻譯的有點生硬。

水平有限，有些英語長句讀著讀著就暈了！

kanhai

小崔開始走國際路線了

cuiluosheng

此文為臺灣成功大學發(fā)布的新聞稿，其中關于檢測結果的部分翻譯更加準確，請各位大俠參考這份為準！
自2009年開始，亞洲蝦類養(yǎng)殖開始爆發(fā)一種未知的新興疾病，漁民發(fā)現(xiàn)在放苗后的30天內，蝦苗會出現(xiàn)大量死亡，因此得名為偷死癥或早死癥 (early mortality syndrome, EMS)。病蝦的肝胰腺會變白及萎縮，且此器官變得難以用手指搓碎；在組織切片檢驗下，肝胰腺細胞呈現(xiàn)壞死及脫落至肝胰腺小管外，亦有大量的血細胞侵入肝胰腺，造成嚴重的發(fā)炎反應。也因為本疾病會造成蝦類肝胰腺功能嚴重受損，因此EMS的正式疾病名則稱之為急性肝胰腺壞死綜合癥 (Acute Hepatopancreas Necrosis Disease，AHPND)。直至今日，此疾病已在中國大陸、越南、馬來西亞和泰國等重要蝦類養(yǎng)殖大國爆發(fā)，平均一年因AHPNS所造成的損失超過十億美元。
        由于AHPND已漸擴展并威脅著全球蝦類養(yǎng)殖產業(yè)，科學家、養(yǎng)殖企業(yè)及第一線養(yǎng)殖業(yè)者共同齊心尋找其致病原因。在2013年5月時，位于University of Arizona，隸屬于世界動物衛(wèi)生組織參考實驗室(OIE reference lab)主持人Prof. Donald V. Lightner首度鑒定出Vibrio parahaemolyticus (VP)乃AHPND的致病原，此研究對于養(yǎng)蝦產業(yè)解決AHPND威脅跨出了重要的第一步。然而，對于蝦類養(yǎng)殖產業(yè)而言，他們亟需檢測平臺以協(xié)助檢測種蝦、蝦苗、生物餌料…等等是否帶有此VP變異株，藉以阻斷病原體在蝦場中的侵入與散布，得以降低AHPND爆發(fā)的可能性。由于致病性VP檢測平臺于蝦類養(yǎng)殖產業(yè)生物安全管理上的必須性及絕對重要性，大家對此都引頸期盼并迫切需要，一旦有高專一性、高靈敏性的檢測平臺建立，將是解決全球AHPND爆發(fā)的關鍵技術。
        本校生物科學與科技學院院長羅竹芳院長帶領其研究團隊，與泰國Mahidol University的Professor T.W. Flegel進行跨國合作，于今年(2013年)12月，領先全球公布了「先導型AHPND關鍵檢測技術平臺」，可以短時間內檢測出致病性VP的存在，并以公開信息的方式，免費提供給全球養(yǎng)蝦產業(yè)使用。在此公開、免費使用的操作模式下，省去準備專利申請文件、證照、商用檢測試劑盒上市諸如此類冗長的等待時間，藉由檢測方式幫助相關業(yè)者制定有效方針因應AHPND爆發(fā)，立即性的阻絕AHPND的傳播路徑，并降低全球養(yǎng)蝦產業(yè)經濟損失。此外，這個關鍵檢測技術平臺的建立，除了是成功的跨國合作案外，藉由國立成功大學、統(tǒng)一企業(yè)總公司、臺灣行政院國家科學委員會以及國立臺灣大學的緊密互動下，成為產學合作、解決產業(yè)困境的典范案例。
        利用了次世代定序及系統(tǒng)生物學方式，羅院長及其團隊利用全基因體解序策略，發(fā)現(xiàn)具有致病性的VP帶有特殊、獨立于染色體DNA之外的大型質體DNA，目前也推測致病的細菌毒素基因也應位于此質體DNA上。因此羅院長利用質體的特殊序列做為偵測目標序列，設計出AP1及AP2等兩對引子對，以PCR技術做為檢測方式，希望能在更深入的研發(fā)過程之前，先以此發(fā)展為「先導型AHPND關鍵檢測PCR技術平臺」。若生物體存在有致病性VP，理論上可同時被AP1及AP2偵測到陽性反應。雖然此檢測平臺的效用還需要大規(guī)模的樣本測試，但由于情況緊急，羅院長及泰國團隊決定先行公開這項初步但重要的信息，得以減緩養(yǎng)蝦產業(yè)因AHPND所造成急遽攀升的經濟損失。
        由于此為「先導型檢測PCR技術平臺」，基于研究責任道義，羅院長團隊及泰國團隊對此提出數(shù)項聲明與前驅檢測成果闡釋，使此技術平臺更加透明化:
1. 在更大規(guī)模的生物樣材測試前，我們不能保證此PCR檢測方式不會對所有非AHPND致病菌及相關生物有反應。我們也不能保證此方法能夠偵測出所有造成AHPND的細菌。但我們誠摯邀請所有相關業(yè)者協(xié)助驗證這項新的檢測方法。
2. 在測試的68個生物樣本中，有67個樣本利用此兩對引子對(AP1及AP2)得到相同的陽性或陰性結果。然而有1個樣本利用AP1得到陽性結果，用AP2則得到陰性結果。
3. 在聯(lián)合國世界糧農組織(FAO) 于越南地區(qū)的研究中，收集的14個樣本中，有5個組織病理切片判斷為陰性結果的樣本，利用此法檢測也同為陰性結果。然而，在8個組織病理切片被判斷為AHPND陽性的生物樣本，利用此PCR檢測平臺檢測后，有5個同樣為陽性結果，但有3個為陰性結果。
4. 在68個被推論可造成AHPND的測試細菌樣本中，利用此PCR方法檢測都呈現(xiàn)陽性結果。而于2002年的池塘采集樣本中，有3株細菌已被確認它們不會造成AHPND也不會造成蝦只死亡，利用此PCR方法檢測后得到陰性結果。
5. 測試過程中發(fā)現(xiàn)有一菌株，蝦體致病后的組織病理切片顯示，雖非AHPND，但實際卻造成蝦只嚴重死亡及不正常肝胰腺病理切片，利用此PCR方法亦是得到陽性結果。
6. 利用此方法檢測Shewanella, Rhodococcus, Leifsonia, Delftia, Ralstonia, V. vulnificus, V. harveyi, V. alginolyticus以及 B. subtilis都得到陰性結果。

        羅院長表示，希望「先導型AHPND關鍵檢測PCR技術平臺」能夠加快對于AHPND傳染機制的了解進而達到最終的疾病控制。此外，羅院長團隊也非常歡迎任何單位使用此方法后所能提供心得及任何寶貴建議。


「先導型AHPND關鍵檢測PCR技術平臺」于AHPND致病菌檢測操作步驟

除了下述的實驗流程之外，用戶也可利用下述序列進行較短的PCR產物反應或巢式PCR法的檢測設計。然而這些經改良的方法會產生許多偽陽性的結果，因此這些改良的方法比較不建議使用。利用AP1及AP2兩對引子對，各自能產生約700 bp的PCR產物。詳細實驗流程如下。
1. 利用一般DNA萃取方法，萃取感染蝦只的胃、肝胰腺或分離的菌株DNA。
2. 于25 μl PCR反應體積中，加入10-100 ng范圍之間的上述DNA萃取物。
3. 兩對引子對(AHPND primer set 1 [AP1]及AHPND primer set 2 [AP2])主要使用在放大AHPND bacterial DNA片段。以下為正股及反股的引子序列:
AP1F: 5’- CCT TGG GTG TGC TTA GAG GAT G -3’
AP1R: 5’- GCA AAC TAT CGC GCA GAA CAC C -3
AP2F: 5’- TCA CCC GAA TGC TCG CTT GTG G -3’
AP2R: 5’- CGT CGC TAC TGT CTA GCT GAA G -3’
4. PCR反應的條件為: [94°C 5分]-[(94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 60秒) 此三步驟重復25~30次]-[最終的72°C 10分]。隨后PCR產物將進行瓊脂膠體電泳之后，經由溴化乙錠染色然后照射紫外線后可看到PCR產物。AHPND陽性的樣本，可看到約700 bp的產物，然而AHPND陰性的樣本則看不到PCR產物。如果需要陽性對照組的話，可以連絡羅院長研究團隊，其可寄送含有目標片段的質體DNA，可以經由大腸桿菌系統(tǒng)放大及保存，可供永久使用。


PCR Protocol
Pre-heat: 94°C, 5min
PCR 25~30 cycles with:
Denaturation: 94°C, 30 sec
Annealing: 60°C, 30 sec
Extension: 72°C, 60 sec
Final extension: 72°C, 10 min
Amplicon: ~700 bp

PCR Primers and Target Sequences
AHPND Primer Set 1 (AP1)
AHPND Primer set 1 Forward (AP1F) –
5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’
AHPND Primer set 1 Reverse (AP1R) –
5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’
AP1 Amplicon- 700 bp
AP1 Target Sequence
CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATGATGAAGATGACTATGTCCTCGAACGATTTGAGTTGCGAGT
TCACGGTCGTAAACCACTCGTTCTCAATCGCCCCTCGTTTTCCAAACTCATGTTCGTCACCC
AGCAGTATCTCCACACGTCACAGGAAACCACCAAGCGAATATTAAGAGCCACCATCTTAGAA
AGTGCTGAGCCCTTCACGGCGGATGAACACTGCCGATTGGTCTCTGCACTCGAAAGGCACTT
AGCTGACGTCCATGAATGAAAAAACCCGATAACATCATCATGTTATCGGGCTATTTGGTGTC
ATCAGTGTGTTTGTGTTTGGCGGTTTTACAACCATTCTTCAGCACATTCATGTGTTATCGCA
TCAGTGGTTTCAGTGATCGTGGCAGACTGAAACCCGCCGACGATGGGATTTAACGCTAAATT
CGCTACTCTCTTCGCCTCATCAAAGCAAGGAAGCACTGCAACGTACTCCTTACCCCAACTCA
CTTCAAGCGTAACTCGGCAAGCACCTTTATACCCAACCGAAACATGAACTTCTGCATCAAGC
CGGTGTTCATCGCCGTTCAATAATGAATTCATCAGCGCGCCCTCGTTAAAGAGCATTAGAAG
TGATGCACTGGAATGTTAAACCAACACACCAATGCATCGTAGAACGCCGAAATAACAGGGTG
TTCTGCGCGATAGTTTGC

AHPND Primer set 2 (AP2)
AHPND Primer set 2 Forward (AP2F) –
5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’
AHPND Primer set 2 Reverse (AP2R) –
5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’
AP2 Amplicon- 700 bp
AP2 Target Sequence
TCACCCGAATGCTCGCTTGTGGCTCAGCGAGCATGGGGTCACGCCTCTATAAGTGCAAAAAC
TCTGGCTGTACCTACTACACCAAATACCTCAATCAAAGCTGTAAGTCTCGAGCTTGCTGCAG
TGGTGGCGTCAAATCCACCGAAAGGTGGATGGTTGCTTAATCGATTATTCAAATGCGCGTCC
AACATTTTAACGACTTGGGCGAAACGGCAAGACTTAGTGTACCCAGAGCCAAAACCTCATCG
AAAATCAGGATTGTTGCTTCCTACGTTGAAAGACCGGCGTTATCAGCTTCATATCCCCCACC
TCTGTCACGCCTGCGTGGATCGCTGAATGACTGTAAAAAATGACAATAAAGATTGATCAATC
TCAGAAACGTTTTGGGACAAAAATGGTTCAACAATATCTGCTGGGTATGTGGCTATCCAAAC
AATATTCTTGATAAAGGCTGGGAAATGGAAAATTCACTCTCCAAATACACCAAATTAGTACA
GAAATTTATACAATTACAGTAACATGAATCCGTCATACTGGCAGCAAGGAGTTCATGTGAGC
CAACAAGAAGAAAAATACCCGGCCAGCGCCATATCCTCCTGGAGCGGCTTTGTTTACCAAGG
AAAAGTCGCACTATATCACTCACTTAAGCTTATTCTCGATGATGATTTGGACTTCGAACTTC
AGCTAGACAGTAGCGACG

如需詳細信息，請點閱以下網址:
http://www.shrimpnews.com/FreeRe ... anFreeEMStests.html

cuiluosheng

kanhai 發(fā)表于 2013-12-26 21:07
小崔開始走國際路線了

被逼的啊，沒有辦法！

syusuke

@Dannyhuang  @拜耳劉濤  @haoye520  @海上積雨云   @蟲子的悲哀
好資料  快來圍觀哦

Dannyhuang

各位好！非常欽佩這些學者的專業(yè)知識和責任感。有幾個問題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原是否已經確證為副溶血弧菌？可能稱之為“一株變異副溶血弧菌的檢測方法”較好。2.好像不是所有患肝胰腺壞死病的對蝦中都可以分離到副溶血弧菌？3.細菌PCR鑒定需要套式PCR檢測嗎？可否更簡單？4.樣本數(shù)。
以上僅供討論參考。謝謝！

煙花雨

Dannyhuang 發(fā)表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常欽佩這些學者的專業(yè)知識和責任感。有幾個問題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原 ...

太高深了，表示看不懂啊！

Dannyhuang

接地氣啊！

cuiluosheng

Dannyhuang 發(fā)表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常欽佩這些學者的專業(yè)知識和責任感。有幾個問題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原 ...

Danny提的問題非常好，可以跟臺灣成功大學羅竹芳教授發(fā)郵件交流你的想法！

hugo

樓主辛苦了，你們這些資料一般在哪個網站找到的呢？我以后也好關注最新信息

hugo

如果跑了電泳之后，還有一個測序結果就更好了，現(xiàn)在還難以確定他們的擴增片段就是目標片段

cuiluosheng

此為免費下載通道！

Dannyhuang

大家比對一下序列，看看是不是？