地衣芽孢桿菌與3種微藻生長的相互影響

cjlittlepig

摘自《農業環境科學學報》

摘要：為弄清水產養殖中常用的有益菌——地衣芽孢桿菌和3 種常見的浮游微藻的相互關系，本文采用陳海水配制的無機培養液和對蝦養殖池水，分別研究了地衣芽孢桿菌對微綠球藻、隱藻和顫藻的影響以及這幾種微藻對地衣芽孢桿菌的反作用。以通徑分析法分析微綠球藻、隱藻和地衣芽孢桿菌對顫藻直接和間接影響力的大小。結果發現，地衣芽孢桿菌對微綠球藻有一定的抑制作用，對隱藻的促進作用明顯，而對顫藻的作用效果不明顯；在與微綠球藻和隱藻混合培養時，地衣芽孢桿菌生長正常，僅在藻細胞密度較大時受到一定程度的抑制；在與顫藻混合培養時，地衣芽孢桿菌受到明顯的抑制作用。通徑分析結果發現，地衣芽孢桿菌與微綠球藻協同對顫藻產生抑制作用，而隱藻對顫藻的作用較弱。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；微綠球藻；隱藻；顫藻；關系

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微藻是水域生態系統中的生產者之一，在水產養殖環境中起增加溶氧、降解氮磷等營養鹽和為早期的水產動物提供優質餌料等重要作用。而細菌是重要的分解者，能夠降解有機物，在物質和能量循環中的作用舉足輕重。據研究，某些異養細菌能夠快速分解藻類所分泌的有機物及死亡的藻細胞，并將其轉化成小分子物質供微藻利用[1-5]，有的細菌甚至能夠分泌維生素B12 等物質，與藻類形成共生關系[6]。目前微生態制劑在水產養殖中已得到廣泛應用，一些有益菌對水生態調控具有明顯的效果[7-10]，但這些有益菌對水中另一類重要的微生物——微藻的影響及有益菌在水中的變化規律則少有研究。本文以較常用的有益菌———地衣芽孢桿菌和對蝦養殖池中幾種優勢微藻為研究對象，研究地衣芽孢桿菌與微藻的相互作用，為在養殖生產中更好地使用有益菌提供理論依據。據Lathrop[11]研究，增加無機氮以改變氮磷比不能使水體免于發生水華，較低的氮磷比只是水華發生的前兆而不是原因，磷的濃度過高才是真正原因，所以要抑制藍藻的爆發應該從其他思路考慮。本實驗也驗證是否能夠通過有益菌和微藻協同作用來抑制顫藻的生長。

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1 材料與方法

1.1 材料

微綠球藻、隱藻和顫藻均分離自廣東省湛江市東海島的對蝦養殖池，保種于中國水產科學研究院南海水產研究所；地衣芽孢桿菌由中國水產科學研究院南海水產研究所自行篩選、分離保存。

1.2 方法

1.2.1 培養條件

微藻以500 mL 錐形瓶培養，恒溫循環器水浴控溫，溫度為26~28 ℃，光照強度4 000 lx，光暗比12∶12，鹽度15，每3 h 搖動藻液1 次，實驗周期為16 d。

1.2.2 容器及培養液的處理

錐形瓶經120 ℃高溫滅菌備用。

無機培養液：陳海水煮沸冷卻后加入NaNO3、KH2PO4 和檸檬酸鐵，使N、P 和Fe 的濃度分別達到14、2 和0.14 mg·L-1。

對蝦養殖池水培養液：從養殖池取水用氯仿固定，測其氮、磷和COD 作為本底參照，再取養殖水煮沸測氮、磷和COD，以NaNO3、KH2PO4 和餌料浸出液調節至符合本底的無機氮0.63 mg·L-1、無機磷0.40mg·L-1、COD 7.80 mg·L-1。

1.2.3 實驗分組

以無機培養液和對蝦養殖池水培養液分別對3種微藻做單種藻和地衣芽孢桿菌混合培養，另設不加菌的微藻培養作為對照。每個組設3 個平行。

在對蝦養殖池水培養液中分別將3 種微藻兩兩混合培養及3 種藻混合培養，加入地衣芽孢桿菌，另設不加菌的微藻培養作為對照。每個組設3 個平行。

1.2.4 接種

將藻液以10 000 r·min-1 離心5 min，去掉上清液；重復洗滌，離心1 次，去除原培養液中的營養；接入500 mL 錐形瓶中，使各種微藻的初始密度均為7×104 cells·mL-1。地衣芽孢桿菌液以8 000 r·min-1 離心10 min，去掉上清液；重復洗滌，離心1 次，接入500 mL 錐形瓶中，使地衣芽孢桿菌細胞密度達到5×104 CFU·mL-1。

1.2.5 取樣及測定

每2 d 取1 次藻樣，以甲醛固定，用血球計數板在顯微鏡下計數（顫藻經過超聲波破碎后計數），取得細胞數（N2d）。地衣芽孢桿菌以稀釋平板法計數[12]，每2 d 測定1 次。

1.3 統計分析

以配對樣本t 檢驗分析加菌對藻細胞密度的影響；以簡單相關分析法分析地衣芽孢桿菌和各種微藻細胞增長的相關性；以通徑分析法分析地衣芽孢桿菌和各種微藻對顫藻的影響。

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2 結果與分析

2.1 無機培養液中地衣芽孢桿菌對3 種微藻的影響

無機培養液中各組微藻生長情況如圖1~3 所示。在微綠球藻和地衣芽孢桿菌混合培養組中，培養初期地衣芽孢桿菌對微綠球藻具有促進作用，培養的前2d 菌藻混合組微綠球藻平均生長速率為0.47，明顯大于單培養組的0.40，但從第4 d 開始，地衣芽孢桿菌對微綠球藻起抑制作用，單培養組微綠球藻的生長速率大于加菌組，第6~16 d 兩組微綠球藻的生物量差異顯著（P＜0.05）。在隱藻和地衣芽孢桿菌混合培養組中，地衣芽孢桿菌對隱藻的生長起明顯促進作用，第6~14 d 菌藻混合組隱藻生物量顯著高于單培養組（P＜0.05）。在顫藻和地衣芽孢桿菌混合培養組中，地衣芽孢桿菌對顫藻生物量的影響很小，各取樣節點菌藻混合組和顫藻單培養組的差異均不顯著。

2.2 對蝦養殖池水培養液中地衣芽孢桿菌對3 種微藻的影響

對蝦養殖池水培養液中各組微藻生長情況如圖4~6 所示。在微綠球藻和地衣芽孢桿菌混合培養組中，培養初期地衣芽孢桿菌對微綠球藻起促進作用，培養的前2 d 菌藻混合組微綠球藻生長速率0.56 遠大于單培養組的0.27，但從第4 d 開始，地衣芽孢桿菌對微綠球藻起抑制作用，第4~16 d 菌藻混合組微綠球藻生物量小于單培養組，差異顯著（P＜0.05），且菌藻混合組微綠球藻的平均生長速率0.27 小于單培養組的0.30。在隱藻和地衣芽孢桿菌混合培養組中，地衣芽孢桿菌對隱藻的促進作用更加明顯，菌藻混合組隱藻的平均生長速率0.25 大于單培養的0.20，第4~16 d 菌藻混合組和單培養組的隱藻生物量差異顯著（P＜0.05），最大生物量分別為392×104 cell·mL-1 和182.3×104 cell·mL-1。在顫藻和地衣芽孢桿菌混合培養組中，地衣芽孢桿菌對顫藻的影響不大，只有第6 d 時菌藻混合組的顫藻生物量顯著大于單培養組（P＜0.05）。

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2.3三種微藻對地衣芽孢桿菌的影響

無機培養液中地衣芽孢桿菌生物量變化如圖7所示。實驗周期中地衣芽孢桿菌單培養的生物量遠高于菌藻混合培養組，最高生物量為11.8×104 CFU·mL-1；地衣芽孢桿菌與微綠球藻混合培養組中，菌和藻生物量的相關系數r=-0.699，P=0.054 （在α=0.05 水平下線性關系不顯著），在第6~8 d 微綠球藻達到較高生物量時，地衣芽孢桿菌受到抑制，而后又有所回升；地衣芽孢桿菌與隱藻混合培養組中，菌和藻的生物量顯著負相關r=-0.894，P=0.003 （在α=0.01 水平下線性關系顯著），在培養的前2 d 藻細胞密度較低時，地衣芽孢桿菌受到促進，隨著藻細胞密度的增大，地衣芽孢桿菌逐漸被抑制，第16 d 菌的生物量為2.3×104CFU·mL-1；地衣芽孢桿菌與顫藻混合培養組中，菌和藻的生物量顯著負相關r=-0.765，P=0.027（在α=0.05水平下線性關系顯著），地衣芽孢桿菌一直被抑制，其生物量在第16 d 為0.2×104 CFU·mL-1。

對蝦養殖池水培養液中地衣芽孢桿菌生物量變化如圖8 所示。實驗周期中地衣芽孢桿菌單培養的生物量遠遠高于菌藻混合培養組，最高生物量達到54×104 CFU·mL-1；地衣芽孢桿菌與微綠球藻混合培養組中，菌和藻的生物量線性關系不顯著（r=-0.386，P=0.345），菌的生物量在4.1×104~7.3×104 CFU·mL-1 之間波動；地衣芽孢桿菌與隱藻混合培養組中，菌和藻的生物量線性關系也不顯著（r=-0.331，P=0.423）；地衣芽孢桿菌與顫藻混合培養組中，培養初期地衣芽孢衣芽孢桿菌與隱藻混合培養組中，菌和藻的生物量顯著負相關r=-0.894，P=0.003 （在α=0.01 水平下線性關系顯著），在培養的前2 d 藻細胞密度較低時，地衣芽孢桿菌受到促進，隨著藻細胞密度的增大，地衣芽孢桿菌逐漸被抑制，第16 d 菌的生物量為2.3×104CFU·mL-1；地衣芽孢桿菌與顫藻混合培養組中，菌和藻的生物量顯著負相關r=-0.765，P=0.027（在α=0.05水平下線性關系顯著），地衣芽孢桿菌一直被抑制，其生物量在第16 d 為0.2×104 CFU·mL-1。對蝦養殖池水培養液中地衣芽孢桿菌生物量變化如圖8 所示。實驗周期中地衣芽孢桿菌單培養的生物量遠遠高于菌藻混合培養組，最高生物量達到54×104 CFU·mL-1；地衣芽孢桿菌與微綠球藻混合培養組中，菌和藻的生物量線性關系不顯著（r=-0.386，P=0.345），菌的生物量在4.1×104~7.3×104 CFU·mL-1 之間波動；地衣芽孢桿菌與隱藻混合培養組中，菌和藻的生物量線性關系也不顯著（r=-0.331，P=0.423）；地衣芽孢桿菌與顫藻混合培養組中，培養初期地衣芽孢桿菌生長快速，但第2 d 起即受到明顯的抑制，菌和藻的生物量呈顯著的負相關（r=-0.889，P=0.003）。

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2.4 藻-菌混合培養中顫藻所受影響的通徑分析

2.4.1 微綠球藻+顫藻+地衣芽孢桿菌混合培養中顫藻受到的影響

通徑分析結果如表1 所示。微綠球藻生物量（Xn）對顫藻生物量（Yo）的直接作用為1.477，但地衣芽孢桿菌生物量（Xb）對微綠球藻生物量（Xn）的負作用減弱了微綠球藻生物量（Xn）對顫藻生物量（Yo）的正作用，所以微綠球藻生物量（Xn）對顫藻生物量（Yo）的總作用為0.902 3，小于其直接作用。同樣，微綠球藻生物量（Xn）n 對地衣芽孢桿菌生物量（Xb）的負作用使地衣芽孢桿菌生物量（Xb）成為主要的限制因子（即限制顫藻生物量（Yo）變化的主要因素）。顫藻和微綠球藻及地衣芽孢桿菌間的多元線性回歸模型為
y=-29.421+0.217Xn+5.262Xb（R2=0.849，F=14.038，P=0.009）

2.4.2 隱藻+顫藻+地衣芽孢桿菌混合培養中顫藻受到的影響

通徑分析結果如表2 所示。隱藻生物量（Xc）對顫藻生物量（Yo）的直接負作用較小，為-0.004，而地衣芽孢桿菌生物量（Xb）對隱藻生物量（Xc）的正作用加強了隱藻生物量（Xc）對顫藻生物量（Yo）的總作用，也加強了地衣芽孢桿菌生物量（Xb）對顫藻生物量（Yo）的總作用，但不明顯。地衣芽孢桿菌生物量（Xb）的決定系數遠大于隱藻生物量（Xc），說明地衣芽孢桿菌生物量（Xb）是主要的決策變量，也就是說，地衣芽孢桿菌生物量（Xb）是對顫藻生物量（Yo）的主要影響因子。顫藻與隱藻、地衣芽孢桿菌間的多元線性回歸模型為y=32-0.002Xc-4.326Xb（R2=0.885，F=19.240，P=0.004）

2.4.3 微綠球藻+隱藻+顫藻+地衣芽孢桿菌混合培養中顫藻受到的影響

通徑分析結果如表3 所示。微綠球藻生物量（Xn）對顫藻生物量（Yo）的直接作用為-0.454，但地衣芽孢桿菌生物量（Xb）與微綠球藻生物量（Xn）的相關系數為-0.959，因此抵消了微綠球藻生物量（Xn）對顫藻生物量（Yo）的負作用。地衣芽孢桿菌生物量（Xb）與隱藻生物量（Xc）的相關系數為-0.163，同樣抵消了隱藻生物量（Xc）對顫藻生物量（Yo）的負作用。從各變量對顫藻生物量（Yo）的總作用來看，微綠球藻生物量（Xn）對顫藻生物量（Yo）的總作用最大，而地衣芽孢桿菌生物量（Xb）對顫藻生物量（Yo）的負作用最大。從決策系數R2（i）來看，地衣芽孢桿菌生物量（Xb）為主要決策因素，而微綠球藻生物量（Xn）為主要限制因素（即微綠球藻生物量（Xn）限制了顫藻生物量（Yo）的變化）。顫藻和微綠球藻、隱藻及地衣芽孢桿菌間的多元線性回歸模型為y=47.563-0.166Xn-0.241Xc-5.442Xb （R2=0.879，F= 9.675，P= 0.026）。

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3 討論

微藻與細菌之間的關系復雜，在有光的情況下微藻通過光合作用吸收二氧化碳產生氧氣，細菌則通過呼吸作用吸收氧氣放出二氧化碳，從這方面看，兩者是相互促進的；但在黑暗中微藻與細菌都只進行呼吸作用，這時兩者又是相互競爭的。除此之外，微藻和細菌也通過胞外產物、營養物質循環等方面相互作用。不同的微藻也有不同的生理特性，本實驗所選用的3 種微藻分別來自不同的門，生理特性差別較大，這就使它們與地衣芽孢桿菌的作用結果不盡相同。微綠球藻在密度低時受到地衣芽孢桿菌的促進作用，而密度升高后被地衣芽孢桿菌所抑制；隱藻則一直受到地衣芽孢桿菌的明顯促進作用；地衣芽孢桿菌對顫藻的作用程度小，加菌組和不加菌組的顫藻生物量差異不顯著。

在單種微藻與地衣芽孢桿菌混合組中，培養初期微綠球藻和隱藻的細胞密度較低時地衣芽孢桿菌的生物量都有一定程度的增加，在微藻的指數增長期，隨著藻細胞密度的增大，地衣芽孢桿菌漸漸受到抑制，但在培養后期微綠球藻組的地衣芽孢桿菌又有一定程度的增加。何曙陽和饒行[13]指出藻類在指數生長期釋放出的有機物含量很少，進入穩定增長期后，開始大量釋放胞外產物，到穩定增長期后期，開始出現細胞的死亡和溶解，使水體中有機物含量迅速增加，這可能也是與微綠球藻混合培養后期地衣芽孢桿菌生物量增加的原因。在與顫藻混合培養中，地衣芽孢桿菌均受到抑制。鄭蓮等[14]研究兩種微藻對凡納濱對蝦養殖環境中細菌數量變化的影響，結果發現，微藻增加到一定密度時能夠抑制弧菌的生長，這與本實驗的研究結果類似。從這3 種微藻對地衣芽孢桿菌的影響對比來看，顫藻對地衣芽孢桿菌的抑制是通過其胞外產物作用的，而非通過營養物質的競爭而產生作用的。

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無機培養液和對蝦養殖池水這兩種培養液中，地衣芽孢桿菌對微藻的作用結果無明顯變化。但在培養初期，對蝦養殖池水中地衣芽孢桿菌對微綠球藻的促進作用更為明顯，中后期對隱藻的促進作用更顯著。筆者認為，地衣芽孢桿菌的作用力之所以得到提高，與培養液中的有機物有很大關系，對蝦養殖水的無菌對照中的地衣芽孢桿菌生物量遠遠高于無機培養液組恰恰證明了該結論。

通徑分析（Path Analysis） 是研究變量間相互關系、自變量對因變量作用方式、程度的多元統計分析技術。地衣芽孢桿菌和其他微藻對顫藻直接和間接的作用可以用通徑分析法進行分析。表1中微綠球藻生物量（Xn）和地衣芽孢桿菌生物量（Xb）對顫藻生物量（Yo）的直接作用為正，而表3 中為負值，這是因為微綠球藻+顫藻+地衣芽孢桿菌混合培養組的總生物量較小，幾種微生物間相互促進，而微綠球藻+隱藻+顫藻+地衣芽孢桿菌混合培養組的總生物量較大，微生物之間形成了競爭。所以在微藻與微藻之間、微藻與細菌之間不存在胞外產物相互作用的情況下，要想使某種微藻受到抑制，就要使總生物量達到一定的密度，這樣才使它們因競爭而產生抑制作用，而在密度較低時產生的作用往往是相互促進。從表3 可以看出，微綠球藻和地衣芽孢桿菌對顫藻的作用較大，從它們對顫藻的總作用來看，微綠球藻促進顫藻的生長，而地衣芽孢桿菌抑制顫藻。但從決策系數R2（i）來看，地衣芽孢桿菌為主要的決定因素，而微綠球藻為主要的限制因素，這說明這兩種微生物對顫藻所產生的主要作用都是通過其他生物來產生作用的。李卓佳等（2002）[7]研究斑節對蝦養殖池塘藻-菌關系，發現在池塘中施用一定量的地衣芽孢桿菌對藍藻具有抑制作用。從本實驗的分析結果看，地衣芽孢桿菌不是直接抑制藍藻，而是其他微藻在地衣芽孢桿菌的作用下對藍藻產生抑制作用或者說是地衣芽孢桿菌間接抑制藍藻。在水產養殖過程中在養殖水體定期補充地衣芽孢桿菌，使其他有益微藻在地衣芽孢桿菌的協同作用下取得競爭優勢，可能會成為抑制顫藻爆發的有效途徑。

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