乳酸桿菌L1對致病弧菌的抑制作用

cjlittlepig

摘自《南方水產(chǎn)》

摘要：以致病弧菌T1、T2為檢測菌，采用平板抑菌圈檢測法，研究乳酸桿菌L1及其代謝產(chǎn)物的抑菌能力。結(jié)果表明：L1發(fā)酵上清液對兩種弧菌的抑制效果和發(fā)酵液對弧菌的抑菌作用相似，即對弧菌T1 的抑制作用強于T2；L1發(fā)酵液對弧菌T1、T2的抑制能力強于上清液，表明乳酸桿菌及其代謝物質(zhì)對弧菌具有協(xié)同抑制作用；L1的發(fā)酵液經(jīng)3倍稀釋仍對弧菌T1 有抑制作用；乳酸桿菌L1生長不同時期的代謝產(chǎn)物對弧菌的抑菌活性不同，代謝產(chǎn)物的抑菌能力在衰退期＞ 穩(wěn)定期＞ 生長期；L1的發(fā)酵液經(jīng)沸水浴處理15min其抑菌活性不變，表明抑菌代謝物質(zhì)具有較好的耐熱性。  

關(guān)鍵詞：乳酸桿菌；弧菌；抑菌能力

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    弧菌廣泛存在于養(yǎng)殖水體，是海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌，弧菌病是目前為止對養(yǎng)殖魚蝦危害最大，造成損失最嚴重的細菌性疾病之一。弧菌病可以發(fā)生在養(yǎng)殖的各個時期，因此防治對蝦弧菌病是養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵因素。防治細菌性疾病最常用的方法是使用抗菌素，但頻繁無節(jié)制的使用藥物，導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生并且造成環(huán)境的污染，因此，抗菌素的有效替代品的研究顯得尤為迫切，應(yīng)用生物及生態(tài)法防治疾病日益受到重視。大量的研究表明［1-7］，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)機體腸道正常菌群，保持微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價，增強機體的免疫功能，提高機體的抗病能力，產(chǎn)生抑菌活性代謝產(chǎn)物，如乳酸菌肽、細菌素、乳酸、過氧化氫、乙酸等，對許多革蘭氏陽性菌李斯特氏菌、芽孢菌、梭菌等及革蘭氏陰性菌大腸桿菌等有強烈的抑制作用，可抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，乳酸菌被作為飼料添加劑而廣泛應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖中，防治腹瀉、下痢、腸炎等腸道功能紊亂的許多疾病。乳酸菌益生素作為魚、蝦飼料添加劑也受到廣泛的研究，有提高養(yǎng)殖動物的免疫力，抵御病原菌的侵襲，提高養(yǎng)殖成活率的效果。體外拮抗實驗是篩選益生菌的重要步驟，本實驗通過乳酸菌體外對致病弧菌的拮抗作用研究，旨在篩選乳酸菌有益菌株，為進一步在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用益生素產(chǎn)品防治病害提供理論基礎(chǔ)及水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病害防治提供一種生物防治方法。

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1材料與方法

1.1試驗菌株

    測試菌：乳酸桿菌L1是經(jīng)點接種法初步篩選出的對弧菌有拮抗作用的菌株。

    指示菌：溶藻弧菌T1是由本所魚病室提供的從患病軍曹魚中分離，并經(jīng)回歸感染確認有致病性的菌株。鯊魚弧菌T2也是從患病軍曹魚中分離。

1.2培養(yǎng)基

    乳酸菌培養(yǎng)基為改良的MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉3g，檸檬酸三銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，水1000ml，pH6.8。

    弧菌培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基。

    檢測弧菌培養(yǎng)基為TCBS培養(yǎng)基。

1.3測定方法

    抑菌活性檢測采用平板打孔抑菌圈測定法。

    平板打孔抑菌圈測定法：制作2216E培養(yǎng)基，無菌操作倒平板，每個平板的培養(yǎng)基厚度為6mm，取指示菌弧菌菌懸液0.1ml，涂布于2216E培養(yǎng)基表面，選擇一定的位置，在無菌條件下，用無菌打孔器打孔，孔徑為10mm，將乳酸桿菌發(fā)酵液注入孔內(nèi)（不能溢出），于30℃培養(yǎng)24h，檢測抑菌圈直徑的大小。以相同pH值的HCl水作對照。

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2結(jié)果

2.1乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物對弧菌的抑制作用
    表1為L1 接種MRS 培養(yǎng)液，經(jīng)24h 培養(yǎng)后的發(fā)酵液及發(fā)酵液經(jīng)5000rpm，15min 離心后取得的上清液，采用平板打孔法測定抑菌圈的大小。
    從表1試驗可看出發(fā)酵液與上清液對指示菌T1、T2 都有抑菌圈，而相同pH值的HCl水卻沒有，可見發(fā)酵液與上清液的抑菌效果并不是pH值低造成的。試驗結(jié)果表明發(fā)酵液比上清液對弧菌的抑菌圈大，說明發(fā)酵液的抑菌活性強于上清液，乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物對弧菌有協(xié)同抑制作用。發(fā)酵液對弧菌T1、T2 的抑菌圈大小不同，上清液也是如此，表明L1 發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物對不同種類弧菌的抑菌活性不同。

2.2不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液及離心后上清液的抑菌活性
        L1 接種MRS，30℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵液用無菌生理鹽水釋稀1、2、3倍，其稀釋液對弧菌的抑菌能力見表2。其發(fā)酵液經(jīng)5000rpm，15min 離心，取得上清液，上清液用無菌生理鹽水釋稀1、2、3倍，其稀釋液對弧菌的抑菌能力見表3。
    從表2、3可看出發(fā)酵液經(jīng)3倍稀釋對弧菌T1仍有抑制作用，上清液經(jīng)1倍稀釋后對弧菌T1的抑菌圈大小與發(fā)酵液3倍稀釋液抑菌圈的大小相近。

2.3不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液的抑菌活性
        L1接種MRS 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)18h、24h、36h、48h、72h、5d的發(fā)酵液的抑菌圈大小見表4。
    從表4可看出，在菌生長的對數(shù)期18h時的發(fā)酵液對兩種指示菌都無抑菌圈，隨培養(yǎng)時間的延長，抑菌圈越來越大，生長衰退期（36h）比穩(wěn)定期（24h）的抑菌圈大，5d的陳培養(yǎng)液的抑菌圈最大。原因可能是隨著培養(yǎng)時間的延長，乳酸桿菌的生長及代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)的積累提高了其殺菌作用；陳培養(yǎng)物和衰退期的發(fā)酵液的抑菌圈大于生長期及穩(wěn)定期的抑菌圈，可能是一些抗菌活性物質(zhì)在乳酸菌死亡后釋放出來。

2.4發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的耐熱性試驗
    將MRS 24h的發(fā)酵液，于60、80℃恒溫水浴中保溫15min，及沸水浴中保溫5、10、15min，與原發(fā)酵液一起作抑菌活性試驗，試驗結(jié)果見表5。
    從表5的試驗結(jié)果可見，發(fā)酵液經(jīng)60、80℃恒溫水浴處理15min，及沸水浴中處理5、10、15min，其抑菌圈大小與未作溫度處理的發(fā)酵液的抑菌圈大小無差異，可見代謝抑菌物質(zhì)具有很好的耐熱性。對蝦飼料制作過程有高溫制粒這一步驟，瞬間溫度可達100℃，益生菌代謝抑菌物質(zhì)具有良好的耐熱性，可避免對蝦飼料制作過程瞬間高溫的破壞，而保持其活性。

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3討論
    體外抑菌試驗是篩選益生菌的手段，通過L1菌株體外對弧菌抑制試驗，結(jié)果表明L1 菌株對致病弧菌T1、T2有較強的抑制作用，而且生長速度快，有望成為微生態(tài)制劑的候選菌種，但能否成為益生菌，還需做一系列的的工作如進一步確定其對宿主有否致病作用，對被選菌株進行致病性評估；對宿主潛在效果的評價等。
    黃滄海等報導(dǎo)乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物對不同血清型的大腸桿菌的抑制作用存在一定的差別，本試驗的結(jié)果也表明，乳酸桿菌L1 對不同的弧菌有不同的抑菌活性。水產(chǎn)養(yǎng)殖動物不同的疾病因病原不同，因此，實際在應(yīng)用益生素制劑時，如果沒有了解清楚益生菌的適用對象和范圍就可能就會有不同的效果。Gatesoupe（1999）［8］通過每天添加乳桿菌在大菱鲆幼體活體食物的輪蟲的培養(yǎng)基中，大大提高了魚的成活率，當病原性弧菌侵襲幼體時，添加的乳桿菌能夠大大降低幼體在9d前的死亡率。因此認為乳桿菌可以防御病原菌-弧菌入侵大比目魚的幼體。而Gildberg等（1997）［9,10］用添加了產(chǎn)乳酸細菌的飼料喂養(yǎng)大西洋鱈，將它們與經(jīng)腹膜內(nèi)感染了氣單胞菌的魚苗一起養(yǎng)殖，在以后4周時間內(nèi)記錄魚的死亡率，結(jié)果表明產(chǎn)乳酸細菌作為魚苗飼料的添加成分可以促進腸微生物的定植，但未出現(xiàn)防止氣單胞菌感染的現(xiàn)象，與預(yù)想相反，在飼料中添加了產(chǎn)乳酸細菌的魚苗的死亡率最高。
    本試驗的結(jié)果表明乳酸桿菌與代謝產(chǎn)物有協(xié)同抑菌作用。因此在評價乳酸菌的抑菌效果時，以乳酸桿菌與代謝產(chǎn)物的協(xié)同抑菌效果作為衡量指標應(yīng)當是更科學(xué)合理。在使用乳酸菌益生素產(chǎn)品時，不應(yīng)當只是利用其菌體，菌體及其代謝產(chǎn)物能一起使用效果可能會更好。

匪兵從良

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逆游的魚

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逆游的魚

逆游的魚 發(fā)表于 2012-7-21 17:36

嗯嗯

apldwf

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